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實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

兔嗅鞘分離自嗅球組織；嗅鞘細胞（OECs）是在功能上介于施旺細胞和少突膠質細胞之間的一種特殊的膠質細胞，具有神經營養、抑制膠質增生、瘢痕形成、成鞘作用等；為軸突生長提供了適宜的微環境及較強的遷移的特性，使其成為促進中樞神經再生的理想候選細胞之一。嗅鞘細胞是目前所發現的極少數的中樞神經系統可以再生細胞之一，其特點為終身具有神經再生功能，還能夠釋放多種神經營養因子、神經粘附分子。被認為是髓鞘化能力強的膠質細胞，逐漸用于治療脊髓損傷。嗅鞘細胞與膠質細胞、雪旺細胞在表現型上有共同點，它們都能促進軸突的再生，主要區別在于嗅鞘細胞不但存在于中樞神經系統，也存在于外周神經中。嗅鞘細胞被認為是一種可塑性很高的細胞，它可表現出多種細胞形態和細胞表面標志，在嗅系統發育過程中，嗅鞘細胞根據其在組織定位的不同而有不同的抗原表型，其中P75NTR、GFAP、和O4可標記大部分在體嗅鞘細胞，然而在嗅球外神經層O4陽性嗅鞘細胞仍然可以在P75NTR陽性細胞層內分化成E-NCAM陽性的細胞層，還有一定比率的嗅鞘細胞P75NTR陰性而NY和S100表型為陽性。嗅黏膜中的神經元是生后才生長并在成年時繼續分化的神經元，壽命為4-12周，隨著新細胞的生長，又建立了新的神經支配關系。嗅鞘細胞存在于嗅神經及嗅球的神經層上，沿嗅神經的全長，從周圍神經系統到中樞神經分布。

方法簡介：

實驗室分離的兔嗅鞘采用-膠原酶聯合消化法、結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔嗅鞘經GFAP免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：神經元、上皮細胞樣

傳代特性：可傳1代，不建議傳代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔嗅鞘體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們聯系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養條件一致，若由于培養條件不一致而導致細胞出現問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現象。觀察好細胞狀態后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養基重懸細胞，并接種到新的培養瓶或培養皿中，置于培養箱中進行培養。

5. 請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的*培養基來培養細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

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